研究背景
结构变异（SVs）是指长度超过50bp的插入、缺失、倒位和移位的基因组序列重组，是构成人类序列的多样性的原因之一。每个个体所具有的SVs数量是少于SNPs和短序列变异（50bp）的，但是它们较大的变异幅度使得其可能具有重要的作用，对疾病有重大影响。
研究表明人类个体平均包含-个SVs。目前大部分研究对全基因组测序都是通过短读长测序方法（SRS）进行，这种方法的读取片段长度普遍在-bp，可对SNPs和短序列变异进行有效鉴别，但是这种方法对于SVs的识别是不利的，大多数研究中，短读长测序方法仅能鉴定出0-10个SVs。长读长测序方法的读取片段长度可达数千bp甚至是几Mb，可对SVs进行更准确的识别。传统的鉴别SVs的方法是通过与参考基因组进行比对组装，而LRS方法可以使得组装过程更加准确，同时LRS可以更大概率的覆盖SVs全长，尤其对SVs的断点和长度可进行更有效的识别。而LRS也具有一定的缺陷，其测序错误率相对较高（通常10%，受样品质量、测序技术和方法的影响），可能还会导致误差无法对SV进行有效识别，尤其是对基因组联合分析等规模化研究中可能会导致假阳性，影响后续分析。目前使用长读长测序方法对人类基因组SVs进行研究报道仅针对一些小数据集分析，规模化的研究尚未有报道。
冰岛deCODEgenetics使用纳米孔长读长测序技术对位冰岛人基因组进行分析，鉴定出位冰岛人人均有22,个SVs（包含13,个插入变异和9,个缺失变异）。研究中发现了一组包含,个可信的SV等位基因，并将这些等位基因在,个个体中进行研究，分析其对疾病和其他表型的影响。研究发现PCSK9的第一个外显子缺失的携带者中低密度脂蛋白水平较平均水平低0.93mmol/L。另外，ACAN基因的一个外显子中一个较长区域包含多个重复序列(长度为57bp的重复序列)，包含了11个等位基因型，并且个体的身高与其携带的这一序列的重复数呈线性关系。这些结果表明，通过这种非特异性的全基因组测序，在一定规模群体数量的情况下可以对SVs进行准确的鉴别，同时对这些SVs与性状进行关联分析。
研究方法和结论
本文研究者首次报道了使用LRS对人类基因组SVs进行群体解析，并利用这些数据与疾病和其他性状进行了后续的关联分析。研究对象为个冰岛人，其中包含个三人亲子组合，DNA样本包括份全血样本和份心脏样本，测序使用OxfordNanoporeTechnologies的PromethION设备，例如SV过滤和启发式组装来提高SV分析的准确度以弥补长度长测序高错误率的缺陷，此外还开发了一个对LRS数据进行基因型联合分析的工具。
所有原始序列在个测序芯片上进行测定，读长序列的测序中长（N50）超过19,bp。参考人类基因组GRCh38组装后发现，LRS覆盖度中值为17.2X（10.0-94.3X），序列与参考基因组的碱基识别率中值为87.6%，错误率为11.6%（插入3.3%，缺失4.5%，错配3.8%）。
高置信度SV集通过四个步骤获得：发现、个体组装、基因分型和数据填充。SVs通过高敏识别，通过SRS数据进行断点预测优化，再经过原始数据验证以减少可能的响应和校正误差。通过每个个体获得的SVs分别根据人的LRS数据和00人的SRS数据进行组装和基因分型。最后将基因变异与,个SNP芯片化的冰岛人的广相单倍型进行重构，明确了一套基于精确拟合及其他多种筛查手段获得的高置信度的SVs数据。
1.SV分析流程
图1SV分析流程。(A)每个样本都经过basecalling及SVs发掘。SVs集通过所有个体数据融合而来，然后分别通过SRS和LRS数据对个体数据进行基因分型。基因分型后的突变型通过单倍型进行归类，SV筛选后的突变型被认可为可信突变型。（B）SV识别路径：Reads通过minimap2参考人类基因组GRCh38进行组装，随后通过Sniffles进行SV预测。预测的SVs通过alternatealleleratio进行预选，然后SV断点通过SRS数据和SViper进行优化。最终利用SquiggleSVFilter对候选SVs进行原始信号数据比对用于后续研究。
本研究中获得了,个规避了对相似位点类似长度进行二次计算的高置信SV等位基因，其中75,个插入，55,个缺失，另外个无法判定。研究者检测到的片段插入现象超过缺失，与常规SRS获得的结果相反。上述结果中，,个SV等位基因（63,个插入，49,个缺失，另外个无法判定）可以匹配到,冰岛人的单倍型。鉴定结果显示，每个个体SVs数中值为22,，平均值为20,，单倍体基因组中的组装长度中值为10.02Mb。与Audano通过LRS获得的SV数据集和gnomAD-SV通过SRS获得的SV数据集中HG的GiaBTier1区域的SV数据进行比较后，研究者评定他们的结果假阴性率分别为2.6%和3.4%，通过类似的方法，假阳性率分别确定为8.2%和6.3-7.6%，考虑到特定群体漂移的情况，这些评估结果可能有一点上浮。使用PCR方法对其中70个SVs进行验证，其中63个SVs验证正确的个数为60，假阳性4.8%，另有7个验证失败。
Audano与gnomAD-SV的数据对比表明，通过SRS获得的gnomAD-SV数据中的SVs存在41.3%的假阴性结果，研究者将其数据进行运算比对后获得的结果与之类似，假阴性为41.9%，输入46,条SV等位基因，条未包含，对串联重复（TR）区域内外的SV进行单独分析，gnomAD-SV的假阴性率分别为47.4%和27.4%。LRS还显著提高了SVs基因型分析，,个SV等位基因中，只通过LRS或SRS获得的SV等位基因分别76,（64%）和（3.2%）个，此外TR区域内外的SV等位基因分别有74.2%和38.6%不能在SRS的结果中发现。以上结果表明LRS对于SV发掘和分型的准确度和可信度均超过SRS数据，尤其是突变率较高的TR区域内的SVs。
2.组装表征SV集
图2组装表征SV集。（A）组装SVs数量和分布。（N=；个个体数据通过SRS数据无法分型，6个分型不完全）（B）50bp~1kband1kb~10kb的SV长度分布堆叠图。插入突变被分类为RE、TD和INS。SVs在长度为bp、2.5kb和6kb时存在三个峰值，分别与SINE、SVA和LINE一致，尤其是RE的增长（N=,，13,个SVs无特殊结构未计入）。（C）每一染色体中控制端粒距离的TR和非TRSVs数目。（D）等位基因分布频率0.05%以上SV分布。（E）基因组SVs信息总览。（F）基因组中rareSVs比例。（E）和（F）中，数值代表均值，误差线为95%置信区间。（N=,，13,个SVs无特殊结构未纳入统计）
与前人结果类似，SVs的数量与长度呈反比。为方便分析，研究者将SVs分为三类，tandemduplications(TD)、retrotransposableelements(RE)和otherinsertions(INS)，分别占比30%、7%和63%。研究者发现，受RE型SVs的影响，SVs在长度为bp、2.5kb和6kb时存在三个峰值，分别与SINE、SVA和LINE一致。研究者还发现染色体端粒区域，尤其是TR区域具有较多的SVs，这也反映了端粒区域的序列信息和TR区域更高的突变率。检测到的等位基因数随着等位基因频率上升而降低，40.1%的等位基因频率低于1%。一般来说频率可以反映个体年龄，年龄越大突变越多，因此，基因组SVs的相对等位基因频率可以为负选择强度提供参考。
研究者观察到与基因组平均水平相比，外显子与非编码调控区，如增强子和启动子，在SVs中比重较低而在rareSVs中的占比较大，同时TRs区域中的SVs比TRs区域外出现频率高，表明TRs区域具有更强的SVs承受能力。尽管调控元件中TRs区域内SVs少于TRs区域外SVs，但他们在
